1935年1月7日，紅軍勝利佔領貴州遵義城。1月15日至17日，黨中央召開中央政治局擴大會議。這次會議，是王稼祥與毛澤東商議後由王稼祥出面提議，並得到張聞天、周恩來、朱德等人的支持而召開的。
在會上，博古做政治報告，為自己的錯誤軍事領導進行辯護。接著，周恩來做軍事問題的副報告，指出紅軍軍事失利的原因是在軍事領導上發生了戰略戰術的錯誤，做了自我批評，也批評了博古和李德。隨後，張聞天（洛甫）做反對“左”傾軍事路線報告，毛澤東接著進行長篇發言。毛澤東在發言中指出博古、李德等的軍事領導是錯誤的，表現為進攻中的冒險主義、防禦中的保守主義和轉移中的逃跑主義。毛澤東發言後，王稼祥站起來，支持毛澤東的意見，批評博古、李德在軍事上的錯誤領導。
周恩來是黨中央最高領導三人團成員、中軍革委副主席、紅軍總政委。他是什麼態度呢？聶榮臻回憶說：
他（周恩來）從長期的實踐中，已經認識到毛澤東同志的見解是正確的，也贊成毛澤東同志出來領導。
在王稼祥發言後，周恩來也接著發言。在發言中，“周恩來……支持毛澤東對第五次反‘圍剿’中單純防禦路線的批評，並全力推舉由毛澤東來領導今後紅軍的行動”。 聶榮臻回憶：
周恩來、王稼祥同志他們兩個人的態度對開好遵義會議起了關鍵作用。
王稼祥是紅軍總政治部主任。周恩來和王稼祥兩人既是博古等人倚重的幹部，也是黨和紅軍中的主要領導人。他們的態度可以左右和決定會議的走向。他們對博古、李德等人的批評和對毛澤東的支持是否成為大家的共識尤為重要。
為什麼？軍事科學院毛澤東思想研究所所長單秀法說：
在博古、李德受到批判時， 周恩來實際上是黨內、軍內最高領導人，又是遵義會議的組織者。如果周恩來在取消博古與李德對軍隊的領導權、是否讓毛澤東出來領導紅軍這個根本問題上態度不明確，或者利用共產國際的權威，仍維持“三人團”的領導（這種可能性是存在的，遵義會議沒有馬上取消博古負總責的情形就是證明），那便難於開好遵義會議。
對於會議中的支持與反對情況，陳雲在傳達提綱中說：
擴大會中恩來同志及其他同志完全同意洛甫及毛王的提綱和意見，博古同志沒有完全徹底的承認自己的錯誤，凱豐同志不同意毛、張、王的意見。
經過與會者三天的激烈討論，會議終於做出幾個至關重要的決定：
（一）毛澤東同志選為常委。
（二）指定洛甫同志起草決議，委託常委審查後，發到支部討論。
（三）常委中再進行適當的分工。
（四）取消三人團，仍由最高軍事首長朱、周為軍事指揮者，而恩來同志是黨內委託的對於指揮軍事上下最後決心的負責者。
會後，中央政治局常委分工，以毛澤東為周恩來軍事上的幫助者。這樣，毛澤東重新回到了黨中央和紅軍的領導地位，與周恩來成為了軍事指揮上的搭檔。
由於王稼祥、張聞天大力支持毛澤東，也由於周恩來與毛澤東的通力合——這種合作既有毛澤東對周恩來的批評和信任，又有周恩來對毛澤東的全力支持，順利地召開了遵義會議，從組織上取消了李德、博古對紅軍的指揮權，肯定了毛澤東軍事路線的正確性，重新恢復了毛澤東對紅軍的領導……
遵義會議是黨和紅軍的命運的一次重大轉折，對周恩來、毛澤東關係來說也是一個大轉變。遵義會議後，名義上週恩來是軍事上下最後決心者，但實際上毛澤東很快成為了軍事上的最高指揮者。周恩來後來回憶：
從遵義一出發，遇到敵人一個師守在打鼓新場那個地方，大家開會都說要打，硬要去攻那個堡壘，只毛主席一個人說不能打，打又是啃硬的，損失了更不應該，我們應該在運動戰中去消滅敵人嘛！但別人一致通過要打，毛主席那樣高的威信還是不聽，他也只好服從。但毛主席回去一想，還是不放心，覺得這樣不對，半夜裡提馬燈又到我那裡來，叫我把命令暫時晚一點發，還是想一想。我接受了毛主席的意見，一早再開會議把大家說服了。這樣，毛主席才說：既然如此，不能像過去那麼多人集體指揮，還是成立一個幾人的小組，由毛主席、稼祥和我，三人小組指揮作戰。從那個時候一直到渡金沙江，從1月、2月出發，到了5月，這是相當艱難困苦的一個時期，走“之”字路，四渡赤水河。從土城戰鬥渡了赤水河。我們趕快轉到三省交界即四川、貴州、雲南交界地方。有個莊子名字很特別，叫“雞鳴三省”，雞一叫三 省 都聽到。就在那個地方，洛甫做了書記，換下了博古。
在“雞鳴三省”換下博古，實際上是黨內總負責人的正式移交。黨中央於2月5日決定以張聞天接替博古負黨中央總的責任，併成立由毛澤東、周恩來、王稼祥組成的中央三人軍事指揮小組，負責指揮全軍的軍事行動。
毛澤東地位的提升，使得周恩來、毛澤東關係由寧都會議前的“周主毛輔”，轉變為遵義會議後的“毛主周輔”格局。 著名的英籍華人作家韓素音也是持如此觀點，認為在周恩來、毛澤東關係中，“遵義會議是一個分水嶺，是一個分界線”。 並且，她肯定這個嶄新的轉變：
這次會議確立了毛澤東在全黨和紅軍中至高無上的地位，它是周恩來和毛澤東之間緊密結合的開端，這種結合終生未變。這並不是一個輕鬆的聯盟，因為它是由一些相反相成的因素構成的：—致與不和，忠誠與怨恨。這兩位偉人彼此之間有一種互相吸引的魅力，因為他們在性格上、思想上和體魄上都完全不同。只有瞭解中國歷史傳統的人，才有可能理解這種結合。……周恩來發現了毛澤東。他發現了一個高瞻遠矚的天才，在這個天才身上，他傾注了自己對中國深摯的感情。
新中國成立後在尼泊爾見過周恩來的英國人狄克·威爾遜說：
在1935年遵義會議上，他（周恩來）作了戲劇性的轉變，從毛的上司和批評者，變成毛的下屬和支持者。這種不尋常的合作關係，後來決定了人民共和國的整個活動範圍和進程……
這種轉變使得周恩來從屬於毛澤東的領導了。但他對這種角色的轉變沒有怨言，是愉快接受的。這種沒有怨言和愉快接受，既源自於為韓素音所說的周恩來對毛澤東的“發現”，也源自於他對毛澤東的“心悅誠服”。
單秀法認為“毛主周輔”這種格局是非常合理的：
周主毛輔的關係轉變為毛主周輔後，他們才在這種既符合中國革命實際，又真實反映兩人本質關係的歷史框架中，各自發揮了雄才大略和聰明才智，不僅勝利地擺脫了蔣介石幾十萬大軍的圍追堵截，挽救了紅軍，取得了長徵的偉大勝利，而且為整個中國革命的勝利提供了組織保證。
因此，在遵義會議後，黨和紅軍在毛澤東的領導下一改以前被動捱打的劣勢，迅即變得主動起來，進入了一個重新煥發出巨力的新階段。
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